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全外显子捕获那些事儿(下篇)

《全外显子捕获那些事儿(上篇)》我们整理了外显子捕获前期建库过程中注意事项,本文将重点梳理捕获部分的注意事项。

*本文相关操作说明以IDT的xGen®️ Exome Research Panel 靶向捕获为例;涉及到的WES相关数据都是利用IDT的xGen®️ Exome Research Panel进行全外显子捕获 

文库的质量首先你得有个靠谱的文库

通过对市面上主流建库试剂盒的对比,我们推荐使用NanoPrepTM系列,Illumina TruSeq系列等产品,以期获得”靠谱的文库“

    外显子捕获表现稳定

“NanoPrepTM建库+IDT xGen®️ Exome Research Panel捕获”的全外显子测序(Whole Exome Sequencing,WES)方案中,表现出高度稳定的可重复性。如图1所示,同一个样本进行两次WES,结果高度一致(Pearson R=0.97)。


    图1. NanoPrep文库外显子捕获的批间重复

     捕获覆盖均一性好

    与建库表现评价相似,捕获覆盖均一性也是重要的考量指标。覆盖均一性越好,后续才能用更少的测序数据量实现对目标区域的有效覆盖,其前提是均一覆盖的文库。

    如图2所示,对比了NanoPrepTM和Vendor K文库进行WES的覆盖均一性.


  图2.  NanoPrep与Vendor K文库进行外显子捕获覆盖均一性。

可以通过不同GC含量探针对目标区域覆盖的变异系数(Coefficiency of variation,CV)来评估覆盖均一性。CV值越小说明均一性越好。利用NanoPrepTM构建的文库(CV=0.58) 相比Vendor K(CV=0.62)在外显子捕获中覆盖均一性更佳。

 文库的混杂: 混得好才是真的好

文库的混杂是指多个样本文库混合进入单次捕获实验。相较于单个文库捕获,混杂后捕获可有效提高生产速度、显著节约成本。然而多文库混杂的方法势必要进行优化,以期获得与前者接近的中靶率和数据产出。

测序数据重复率

   混杂比计算方法如下所示,其本质为进入捕获步骤的文库丰度。混杂比越高则文库丰度越高,相应的测序数据的重复率(Duplication rate)也较低,从而提升测序的有效数据量。


那一般来讲,每个文库投入多少进入混合捕获呢?混杂比达到多少比较合适呢? 我们通过IDT的相关测试和NanoPrepTM的实战经验来阐述这个问题

IDT以下两种方法进行不同水平的文库混杂:

方法一对混合文库取500 ng总量,平均分摊到每个文库;

方法二每个文库均取500 ng。

调整单个文库实际建库产出为500 ng,则混杂比计算如表1:

表1. 两种文库混杂方法



结果表明,方法一,重复率随混杂比降低而明显升高(图3, 橙色);  方法二,混杂的文库数量不同但高混杂比(100%)时,重复率无明显差异(图3, 蓝色)。方法一进行16-plex时,混杂比为6.25%,平均重复率为13.5%,与1-plex(混杂比为100%)相比,重复率扩大了近5倍。


图3. 不同混杂方法下每个文库的重复率。样本:gDNA样本;文库构建:相同建库流程;杂交捕获:xGen AML Panel;测序:Illumina NextSeq;数据分析:单个文库在相同测序量下,使用Picard’s HsMetrics进行生信分析[1]。


此处的测序平台为Illumina NextSeq®️。而现有WES常见模式为多样本混合后“凑lane”在HiSeq-X®️或NovaSeq®️这类高通量测序平台进行混合测序。这些平台的天然重复率偏高(详见《二代测序中Duplication Rate杂谈》)。因此,我们进一步分析了HiSeq-X平台上的混杂WES测试结果。


利用NanoPrepTM构建的12个或16个文库混合进行单次捕获实验,即常说的“12杂(12-plex)”与“16杂(16-plex)”。混杂的原则,遵循我们在前篇提到的:“推荐用于WES的DNA文库通过循环数控制产出在600~1,000 ng之间。取~500 ng用于捕获,确保混杂比达到50%或以上。”(详见《全外显子捕获那些事儿(上篇)》)


NanoPrepTM文库12-plex(6μg总量)和16-plex(8μg总量)进行WES的结果如图4所示。结果显示12-plex和16-plex平均中靶率(Flanked On target%)分别高达92.18%和86.20%,重复率分别为7.36% 和7.66%。


图4. NanoPrep文库在12-plex和16-plex下外显子捕获表现(A)不同混杂水平下外显子捕获中靶率与重复率;(B) 不同混杂水平下覆盖较为均一。以上测试,样本均为外周血来源的gDNA样本,采取Illumina HiSeq-X PE150进行测序,每个文库选取 35M reads 数据,利用BWA工具比对到GRCh37/hg19参考基因组,按照Reads计算中靶率


以上表现数据与我们常见的单杂无本质差别,因此证实多样本捕获切实可行。然而值得注意的是,16-plex时中靶率略有下降,这是因为>6 μg的总文库量在捕获探针与目标分子比率上已非最佳动力学状态,中靶率因此受到影响。

灵活调整混杂比例

进行混合捕获时,若每个文库期望测序数据产出一致,我们推荐每个文库500 ng进行等量混合;若根据不同的检测目的,期望不同的数据量产出,可以根据所需数据比例混杂,如表2 所示。另外,当文库总量限制时,也可根据实际情况进行调整。

表2. 根据期望数据产出比例混杂文库示例



关于混杂比的详细信息,可以查看《二代测序中Duplication rate 杂谈(二)》。

封闭非特异序列: 提升捕获效率的重要助力

在进行人类全外显子捕获中,我们强烈建议大家根据文库类型使用封闭文库接头的封阻序列(xGen®️ Universal Blocker-TS Mix)和封闭基因组重复序列的Human Cot -1 DNA(包含在 xGen®️ Hybridization and Wash Kit中)。以上两个组分可以降低接头间和重复序列间的非特异性结合,进而降低脱靶率,从而提升有效捕获数据比例(图5)。



图5. (A)基因组中的重复区域和文库接头通用序列易引入脱靶分子天天彩票下载app(B)Illumina TruSeq文库使用xGen AML Panel进行捕获时,对常见的多种index序列接头,均可被xGen Universal Blocker-TS Mix高效封闭,显著提高中靶率。

如果您使用的建库方法为快速建库的Illumina Nextera系列,建议配套使用IDT xGen®️ Universal Blocker-NXT Mix封阻序列

    精准控温:高效捕获的关键一步

在NGS杂交洗脱操作中即使温度发生了轻微改变,如±2 ℃,都可能会对Flanking区域的中靶率以及GC偏好性(GC bias)产生影响。

NGS数据中GC bias被认为是衡量捕获均一性的重要指标之一,所以校准实验仪器的温度是必须要考虑的因素。略高的洗脱温度,会导致对GC区域捕获的损失;略低的洗脱温度,会导致非特异性捕获增加,中靶率下降。

例如,在国内南方冬天时候,室内的温度有时偏低,偶尔会出现捕获后文库产量超出经验值,测序结果中靶率显著降低的情况。这种情况,一般都是因为热洗脱步骤温度偏低造成的。 严格控制杂交洗脱温度非常重要,尤其是在“热洗脱”步骤。我们建议洗脱操作要迅速,并且使用前至少65℃预热15 min 热洗脱Buffer。

 M-270磁珠操作:“抓娃娃”多面手

链霉亲和素磁珠(Dynabeads®️ M-270 Streptavidin Beads, M-270,包含在 xGen®️ Hybridization and Wash Kit中)用于与探针5'端生物素修饰结合,在磁力架的作用下富集并洗脱靶向区域DNA。在实验操作中需要注意以下几点:

天天彩票下载app 1.避免在任何时候让M-270过于干燥。如果必要,可以轻微延长洗脱时间,防止M-270过干。

2.磁珠捕获时,在杂交文库与M-270磁珠65℃孵育45 min期间,每10-12 min混匀一次,会增加磁珠与靶向目标文库分子探针的结合,提升捕获表现。

3.室温洗脱步骤时,需要确保M-270磁珠充分重悬,充分重悬能够提高最终外显子捕获数据质量。推荐大家遵循说明书进行操作:室温孵育期间充分涡旋混匀,涡旋过程中少量磁珠飞溅在密封盖上并不会对捕获结果产生影响。

捕获后PCR:适可而止

与建库步骤中相似,WES捕获后扩增,我们建议依据杂交时间、混杂数目选择相应的扩增循环数,避免过度扩增。IDT的WES捕获实验支持快速杂交(4h)和过夜杂交(16h)。

表3. NanoPrep建库体系推荐的WES捕获后扩增循环数



以上,就是我们针对外显子捕获的相关建议,有任何技术问题,欢迎联系纳昂达技术支持support@nanodigmbio.com。

覆盖~20,000个基因CDS区域的WES用途甚广。近期业内大号也出了不少综述文章。与此同时,WESPlus 层出不穷,其本质是以核心外显子为基础补充其他疾病相关位点。《全外显子捕获那些事儿》上篇和下篇中提及的操作手段和相关建议均适用。如有任何技术问题,欢迎公众号留言。

NanoPrepTM DNA文库构建系列


参考文献

[1]Picard’s HsMetrics, https://broadinstitute.github.io/picard/picard-metric-definitions.html [Accessed 8 Mar, 2018].


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