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叮~待签收 | 升级版捕获操作指南

NGS实验步骤繁杂,对于细节处理的差异直接影响下游数据的可重复性。IDT公司针对靶向捕获进一步优化了操作说明,并于2018年中推出了与之搭配的升级版杂交洗脱试剂xGen®️ Hybridization and Wash Kit,帮助NGSer玩转捕获。

新试剂及升级版操作说明的亮点总结如下。

图1.  升级版杂交洗脱试剂盒—xGen Hybridization and Wash Kit

亮点1—组分升级

xGen®️ Hybridization and Wash Kit在组成上将常规捕获实验必备的Human Cot DNA与链霉亲和素磁珠M270也收归其中,无需另外采购。

同时IDT也会出具包含以上2个组分的全套试剂性能验证(Certificate of Analysis,COA)。新旧版杂交洗脱试剂的差异可见表1:

表1. IDT新旧两版杂交捕获试剂组分比较


亮点2—操作优化

IDT旧版的操作指南,杂交捕获反应在独立的离心管中完成,即Tube操作模式,在该模式下IDT不建议同时操作超过6个捕获反应。这种操作模式大大限制了捕获反应的通量。新版操作指南中,IDT推荐使用通量更高、重复性更好的Plate操作模式。

对于Plate操作模式,IDT推荐使用96孔板中间孔,同时进行不超过32 个反应杂交试验。我们不建议同时进行超过32个反应的Plate的手动操作,这可能会影响热洗脱步骤的控温



2.  IDT推荐使用96孔板中间孔

对于“组分升级,操作优化”的新版杂交操作指南,纳昂达进行了对比试验。各取500 ng 由NanoPrep™建库系列构建的gDNA文库,分别使用新、旧版杂交试剂和相应操作说明,利用547基因大Panel进行靶向捕获对比实验。如表2所示,对2 M Reads进行分析,两者在中靶率、重复率和深度等参数未见明显差异。

表2. 新旧版操作指南靶向捕获质控数据*



在覆盖均一性上,新版略优于旧版(图3),两者的CV均维持在较低的水平(CV新版=0.24,CV旧版=0.25,图4)


图3.  不同杂交试剂操作下的覆盖深度对比

图4.  不同杂交试剂操作下靶向捕获覆盖度

亮点3—操作优化

新版操作说明在常规真空浓缩文库的基础上,新增了磁珠浓缩这一可选方案。


磁珠浓缩的方法不需要真空浓缩仪,且在混杂样本较多的情况下,用时较短。因磁珠与序列的结合可能存在碱基偏好性,纳昂达利用NanoPrep™ 建库系列构建的gDNA文库进行了“磁珠浓缩”和“真空浓缩”的对比试验。

同一NanoPrep™文库与封阻序列xGen®️ Universal Blockers (货号:1075475)及Human Cot DNA(包含在xGen®️ Hybridization and Wash Kit中)混合后,分别使用两种浓缩方法,得到干燥的产物,再进行约1.1 M大小Panel靶向捕获对比实验。如图5,结果显示,两种方法对不同GC%区域的覆盖未见明显差异。


图5.  磁珠/真空浓缩法捕获覆盖度

由于磁珠浓缩法可能引入的损耗,这种方法对于捕获探针、Human Cot DNA和纯化磁珠等试剂的使用量相对较多。具体详情请联系纳昂达技术支持 support@nanodigmbio.com 

亮点4—适配自动化

自动化是NGS的大势所趋,IDT也应势而为向广大用户提供了适配于自动化平台的操作方案(图6)。


图6. IDT提供适配 Sciclone workstation 平台自动化操作指南、、

目前IDT提供适配Perkin Elmer Sciclone®️ workstation自动化操作指南,后续也将陆续推出适配其他自动化平台的捕获方案。

实践证明,在步骤繁琐的杂交捕获实验中,自动化平台拥有着不逊于手动操作的捕获均一性以及中靶率。如图7显示Sciclone®️ G3 平台使用IDT全套试剂进行全外显子捕获,对NextSeq测序仪50 M reads的下机数据进行分析,>95%碱基有超过>30 X的覆盖,Flanked on-target% 在90%左右。

图7. IDT xGen®外显子捕获全套产品在Sciclone平台的数据表现

这里,纳昂达整合了IDT的指导建议,配合新版操作指南—xGen®️ hybridization capture of DNA libraries,为NGSer总结了以下几个要点的实验操作注意事项。更详细的操作说明可以参考我们之前的《外显子捕获那些事儿(下篇)》。

  •  提高杂交文库的Input量,增加文库多样性

         目前,IDT推荐500 ng/文库,保证文库丰度。针对全外显子捕获,混合文库总量可达6 μg。


  •   使用接头封阻序列与基因组重复的序列,提升中靶率。


         我们强烈建议大家使用适配A-T连接型文库的封阻序列xGen®️ Universal Blocker-TS Mix和封闭基因组重复序列的Human Cot -1 DNA。若进行的是非人类基因捕获文库,需要用相应富含重复序列的DNA来封闭重复序列,如Mouse Cot DNA、Salmon sperm DNA。


  • 杂交、洗脱步骤精准控温,保证均一、高效捕获。


天天彩票下载app         尤其需要注意的是65℃杂交步骤与热洗脱步骤。建议在热稳定性更好的PCR仪上进行操作。


  • M-270磁珠操作。


        在整个实验过程中,要避免任何时候M-270过于干燥。在捕获和洗脱步骤中,细节之处也要遵循实验说明书:65℃下M-270与杂交文库孵育期间,每10~12 min混匀一次;室温洗脱步骤时,充分涡旋混匀M-270磁珠。


  • 细节操作要重视。


天天彩票下载app         杂交反应过程中,一定要确保杂交反应Tube或者Plate的绝对密封,并且避免使用PCR板的外层孔,因为杂交反应液的额外蒸发可能导致捕获实验的失败。为了避免意外蒸发对实验的影响,我们建议预先进行杂交损耗测试:使用蒸馏水代替杂交体系,65℃ 12 h损耗应< 0.5 μl,确保Tube及Plate的密封性。


天天彩票下载app         对于Plate操作,每一个步骤都要使用新的密封盖,避免样本之间的污染。


  • 根据实验具体情况,灵活相关实验参数。


天天彩票下载app        如捕获后PCR循环数,我们建议依据杂交时间、混杂数目选择相应的扩增循环数,“适可而止”,避免过度扩增(表2)。对于杂交时间,新版操作指南依旧支持4 h快速杂交捕获,但是对于小Panel来说(< 1,000 probes)适当延长杂交捕获时间,可以适度提高捕获表现。

表3. 不同Panel大小和混杂水平

推荐的捕获后扩增循环数

目前,新旧两版杂交洗脱试剂盒过渡阶段,很多客户一直在使用的xGen®️ Lockdown®️ Hybridization Buffer也是完全兼容新的操作指南,只是新的操作指南对Hybridization buffer的使用量稍多,在现有试剂的基础上额外订购一管xGen®️ Lockdown®️ Hybridization Buffer 即可。

欢迎联系support@nanodigmbio.com,400- 8717 -699获取最新版的操作指南。您可能感兴趣:

数据来源于IDT及纳昂达内部测试。



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