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【新品上市】给你的接头披上“金钟罩”

DNA甲基化作为一种表观调控机制,可以调节基因的表达。生长发育、疾病、环境、压力等因素均会影响DNA甲基化修饰模式(Methylation pattern)。Methylation pattern的改变在细胞分化等正常生长发育过程中是必须的,但是在“无限分裂”的癌细胞中会出现异常[1]。近年来多篇研究文献表明,DNA甲基化可以作为标志物应用于癌症早诊早筛,越来越多的研究人员利用更高通量的NGS对其进行深入研究[2]。亚硫酸氢盐转化(Bisulfite conversion)以其可达到单碱基的分辨率成为甲基化研究的“金标准”[1]


图1. DNA甲基化[3]天天彩票下载app(A)DNA甲基化发生在胞嘧啶的第五个碳原子;(B)DNA甲基化多发生在CpG处,也可以发生在非CpG中。

如图2所示,BS通过亚硫酸氢盐介导未甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U),甲基化的C维持不变。这个过程将“修饰信息”转化为“碱基信息”,后续通过测序即可对甲基化修饰信号进行检测。


图2. 亚硫酸氢盐转化过程[4]。

全基因组甲基化测序(Whole genome bisulfite sequencing, WGBS)和甲基化捕获技术(Methly Capture Sequencing)是基于Bisulfite conversion的两种常用的甲基化检测方案,均需进行文库构建。表1列出了三种建库的流程。

表1. 甲基化建库实验流程



对于建库步骤,根据亚硫酸氢盐转化(Bisulfite conversion)的先后分两大类——“接头优先”与“转化优先”。在起始量充足的情况下,差异不大,但是在有限的起始量情况下,“转化优先”的单链连接法PCR-duplicate受影响较小[5]

以上3种建库方法中, Pre-bisulfite conversion方法使用时间最久,建库的连接模块通用于市场上基于A-T连接原理的试剂盒。Bisulfite conversion过程中,会遭遇高温、高盐等严苛的条件,会出现单双链混合、断裂等损伤,造成原始DNA分子的减少。目前市场上一些商品化的Bisulfite conversion试剂盒用温度变性替代了之前的化学变性,尽可能的在转化率和DNA降解度寻找一个平衡[6]。Pre-bisulfite conversion建库方法仍有广泛的应用。

Pre-bisulfite conversion建库的接头模块与普通建库不同,接头必须披上“金钟罩”,即所有的C均需要修饰为Methyl dC,帮助接头安然无恙的度过Bisulfite conversion的“折磨”,直至上机测序。

以带有8nt UDI的接头为例,一个Y型的接头共有40余个C,占整体碱基数的约30% 。一个Methyl dC的价格是普通C的50倍以上,小规格定制甲基化接头成本较大。因此,纳昂达向以“接头优先”方式建库的客户提供商品化的甲基化接头(表2)。


表2. 甲基化接头产品信息


与纳昂达目前在售的其他接头一致,Methylated 8nt UDI Adapters同样均含有UDI 样本标签,帮助剔除全流程产生的样本标签错配。详情可参考《接头暗语》。

甲基化捕获结合了甲基化芯片和WGBS的优势,可针对感兴趣的目标区域进行甲基化分析,节约了经济和时间成本,可同时对多个样本进行分析,并可达单碱基分辨率。

同样的,甲基化捕获根据Bisulfite conversion过程的先后,也主要有以下三种方案:


图3. 甲基化捕获方案[5]。(改编自Swift 官网)

纳昂达甲基化接头,可以满足上述方案1 和方案2的建库流程。对于捕获探针设计方面,方案1目标片段为原始DNA,IDT可以为客户在线提供针对hg19参考基因组的IDT探针设计。甲基化通常存在于CpG岛等高GC区域,独立合成,独立质检的IDT探针在GC-rich区域的一直以来也有优秀表现(图4)。


图4. IDT xGen Exome Research Panel 在GC偏好性更小。不同品牌全外显子测序数据与全基因组测序数据对比,IDT对GC-rich区域有较好对覆盖。

针对方案2和3,先转化后捕获的操作流程,我们也可以协助客户进行探针设计。值得一提的是,IDT独立合成,独立质检120 mer生物素修饰探针,可以容纳7 bp碱基错配,7 bp以内的碱基错配导致的Tm值波动<5℃(图5)。这种小幅度的Tm值变化不会影响捕获效率。这种特性,使得IDT探针可以天然容纳多个位点的甲基化变化。


图5. 120 mer 探针中不同个数的错配对Tm值的影响。

先转化后捕获的探针设计方案略有复杂,感兴趣的老师可以联系纳昂达技术支持 support@nanodigmbio.com,400 8717 699。


基于Bisulfite conversion结合NGS的分析方法尽管仍存在降低基因组复杂度、损伤DNA、具有转化偏好性等问题,但是仍为甲基化标志物在癌症早筛早诊研究中的重要方法之一。纳昂达会继续用多样的产品和方案帮助研究者在甲基化研究领域向前推进


参考文献

[1] Lvanoov, M,; Kals,M, et al. In-solution hybrid capture ofbisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research 2013

[2] Xu, RH,; Wei,W, et al. Circulating tumour DNA methylationmarkers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nature Materials 2017

[3] Jang,HS,; Shin WJ, et al. CpG and Non-CpG Methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Gene 2017

[4] https://www.diagenode.com/en/applications/dna-bisulfite-conversion

[5 https://swiftbiosci.com/products/accel-ngs-methyl-seq-dna-library-kit/


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