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上新 | 高编辑效率Alt-R A.s. Cas12a(Cpf1) Ultra

5月30日,Integrated DNA Technologies正式上线其开发的CRISPR基因编辑新工具Alt-R A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra 蛋白,几个月前IDT已经对其在人类基因治疗应用方向,与Editas Medicine 签订了独家授权协议。



Editas Medicine, Inc.(纳斯达克股票代码EDIT)是最早IPO的CRISPR公司,其由张峰和Jennifer Doundna等人于2016年9月联合创办。

2016年Editas取得了the Broad Institute等机构的针对多种CRISPR酶在人类基因治疗应用方向独家授权。2018年底FDA批准该公司开展利用CRISPR编辑手段治疗Leber先天性黑内障10(LCA10)






CRISPR-Cas12a首次发表于2015年,引导RNA(guide RNA, gRNA) 识别TTTV(V=A/G/C) PAM位点,作为CRISPR-Cas9(PAM位点为NGG) 的补充,扩展了CRISPR系统可编辑的位点1


上图为Cas12a 酶与Cas12a crRNA结合形成Ribonucleoprotein complex(RNP)。 crRNA包含两部分,20 base通用的环装结构域(深绿色)和20-24 base的目标特异Protospacer元件(蓝色)构成。


天天彩票下载app 尽管研究表明野生型A.s. Cas12a在人类基因组编辑活性低于野生型S.p Cas9(图1),但是该系统gRNA较短(40-44 nt),具有较高的编辑特异性,适用于AT-rich基因组等特点,使其仍为CRISPR工具箱里的利器之一。


图1. 野生型CRISPR-Ca9和CRISPR-Cas12a (Cpf1)以电转RNP的方式对HEK293细胞系STAT3基因Exon5 &6基因编辑效率对比。


A.s. Cas12a Ultra优异表现


为了满足基因组学研究的前沿需求,针对野生型Cas12a酶基因编辑效率低,对TTTT PAM位点不敏感等局限,IDT对多种Cas12a突变体进行了筛选及改造,新推出Alt-R A.s. Cas12a Ultra蛋白,Acidaminococcus sp. BV3L6 Cas12a (Cpf1)突变体,具有以下几个特点:


  • 整体提高Cas12a系统在人类细胞的编辑效率,可媲美Cas9的切割活性

  • 使Cas12a系统对PAM位点为TTTT的目标区域编辑成为可能

  • 天天彩票下载app 室温下具有活性,更广泛的温度适用范围可以应用于植物等其他生物编辑



图2. Alt-R A.s. Cas12a(Cpf1) Ultra 整体提高基因编辑效率。野生型和Cas12a Ultra与靶向Jurkat细胞系120个位点及靶向HEK-293 细胞系96 个位点crRNA组装形成多种RNP。在Alt-R Cas12a电转增强剂的辅助下将 RNP(4μM)转入目标细胞系中。利用二代测序方法进行基因编辑效率分析。



图3. Alt-R A.s. Cas12a Ultra以RNP的形式在HEK293细胞系 CTNNB1 基因多个PAM序列为TTTT的目标位点启动基因编辑。


优化的CRISPR-Cas12a系统


天天彩票下载app CRISPR Cas12a系统可以RNP的形式,也可以“Cas12a蛋白稳转细胞系+ crRNA”的形式发挥作用。基于简化实验方面(图5)和降低脱靶率(图4)等方面考虑,IDT建议首选电转 Cas12a 的 RNP 复合体的方式。



图4. CRISPR-Cas12a RNP形式比质粒形式脱靶率更低。

 

天天彩票下载app IDT Alt-R CRISPR-Cas12a体系使用简单,1小时左右即可完成实验操作。实验仅需两步:

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图5. IDT Alt-R CRISPR-Cas12a工作流程。

 

除了提供优化的Cas12a蛋白,IDT还提供专利修饰的Alt-R Cas12a crRNA,修饰可保护crRNA不被细胞内RNases降解,进一步提高编辑效率。

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天天彩票下载app IDT研究表明,crRNA的长度优化可以提升对哺乳动物基因编辑的表现。整体来说, 21mer Protospacer元件的crRNA在绝大多数目标位点,具有最佳的编辑效率。(图6)




图6. 不同长度crRNA的基因编辑表现。针对 HPRT 基因设计不同长度的 crRNA 用 Lipofectamine® RNAiMAX TM 试剂 (Thermo Fisher) 将 crRNA 转染至稳定表达A.s. Cas12a 的 HEK-293-Cas12a 细胞系中。随后用基于T7EI核酸内切酶错配切割原理的Alt-R Genome Editing Detection Kit进行基因编辑效率检测。


电转好伙伴—电转增强剂


天天彩票下载app 不同于CRISPR-Cas9系统,Cas12a RNP复合体较难利用脂质体转染。IDT推荐搭配使用电转增强剂—Alt-R Cas12a Electroporation Enhancer进行电转RNP。


该电转增强剂是Cas12a系统的专用单链carrier DNA,设计时特异避免在人、大鼠、小鼠基因组的同源型,辅助RNP在培养细胞中的高效电转,从而提高系统的编辑效率。

 

如图7所示,该产品可以提高在RNP复合体在小鼠Hepa1-6细胞系和人HEK-293细胞系靶向HPRT基因多个位点编辑效率2



图7. Cas12a电转增强剂产品表现。48小时后提取基因组DNA,并PCR扩增目的片段,随后用基于T7EI核酸内切酶错配切割原理的Alt-R Genome Editing Detection Kit进行基因编辑效率检测。

以上就是我们对CRISPR-Cas12a系统的一个简要介绍,后续我们将会给大家带来更多的关于IDT Alt-R CRISPR系列产品的表现与应用。

 

IDT领先的蛋白重组和合成,以及世界一流的技术支持,都将使IDT Alt-R CRISPR系列产品成为服务广大研究者触手可及的“百宝箱”。

 

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参考文献

1.Zetsche B, Gootenberg JS, et al. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 163(3):759–771.

2.https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/crispr-cpf1-an-alternative-to-cas9-for-targeting-at-rich-genomes



产品介绍



Cas12a(Cpf1)Nuclease



CRISPR-Cas12a(Cpf1) crRNA



Cas12a Electroporation Enhancer


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