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NGS接头暗语


近些年来,测序仪型号更迭,不断刷新测序通量的纪录。变的是越来越高的测序通量,不变的是Illumina的多样本混合上机和文库构建策略。二代测序文库构建,即对每个样本通过酶连或PCR扩增,引入样本标签(index / barcode)。每个样本在文库构建中都带上了独特的“号码牌”,这便是混合上机后,生信工程师数据分析时的“接头暗语”。在“茫茫reads海”帮助“目标样本”找到属于自己的那个“她”。因此,“接头暗语”也随着测序仪器型号的更新而升级。




图 1. Illumina不同仪器型号采取Non-patterned Flow Cell或Patterned Flow Cell模式


接头暗语| 种类更多样




Y型接头自Illumina 推出以来,仿者众多,但是万变不离其宗。随着Illumina高通量测序仪器的在行业内的普及,为了满足更高的样本通量需求,index的长度从6nt增加到8nt / 10nt,甚至更长,以期设计更多“号码牌”,满足更多数目的混样需求。

接头暗语| 标记更准确



文库构建完成以后,“接头暗语”经过混合捕获,混合测序等步骤后被生信工程师接收到。考虑到测序的多个环节都可引入误差,通过一定的机制来剔除“接头暗语”传播过程中产生的信息错误是必不可缺的。

为了弥补NGS整个流程中,尤其是应用Patterned flow cell与ExAmp技术的测序平台上凸显的标签跳跃(Index hopping)问题。Illumina提出了“Prepare dual indexed libraries with unique indexes”的策略[1]



图 2. 标签跳跃问题显著存在于Patterned Flow Cell测序平台[1]。

天天彩票下载app 因此,在文库的P5和P7端都带上独特的标签(Unique dual index,UDI),两端交叉检验,避免index hopping的干扰也是对新一代“接头暗语”的更高要求。这种机制帮助生信工程师从最终的下机数据进行质控,解决NGS整个流程多个步骤可能引入的index hopping问题,大大控制了标签错配(Index misassignment)的现象。



图 3. 文库构建中引入UDI形式的样本标签可通过双端index的匹配来避免串扰reads进入下游数据分析[2]

美国Integrated DNA Technologies(IDT)公司,作为世界上定制核酸合成服务的领头羊,其行业领先的耦合效率(图 4.A)和生产全过程的质检(图 4.B),可以有效剔除含有错配碱基和截短序列,为客户生产优质的接头,控制由于接头index相关序列的错误导致的样本串扰(Sample crosstalk)。



图 4. A. IDT DNA oligo生产过程的高耦合效率;  B. IDT生产接头质检文件示例:退火型接头的2条单链序列都会经过电喷雾电离质谱技术(ESI-MS)进行质检。

天天彩票下载app 因为IDT在核酸合成领域里的领先地位及能力,2017年5月,Illumina与IDT在NGS相关技术领域达成合作协议,IDT为NoveSeqTM等基因测序仪器提供UDI接头。这种接头加强了文库制备的可靠性,提高系统多重样本检验的能力。

接头暗语| 检测更灵敏



目前最新的“接头暗语”承载了比以前更多的信息,接头中的分子标签(Unique molecular identifier,UMI)标记了原始的DNA片段分子,使“接头暗语”不仅传递了样本信息,更传递了原始的样本DNA片段的信息。

分子标签,在文库构建过程中连接在DNA分子上,用于“冻结”文库分子前的扩增状态,在生信分析步骤,用来去重复(De-duplication),回溯和验证测序结果在原始DNA上的一致性,剔除假阳性。分子标签在低频突变检验中扮演着重要角色,帮助突破NGS检验下限。

下面我们按照功能,梳理了下IDT在售的不同接头:

TSHT · 单端index

TSHT(TruSeq Highthroughput)接头仅在P7端存在8 nt的index。



 图 5. TSHT接头相关结构和产品信息。


UDI · 双端唯一index

含有UDI,可以进行双侧校验,剔除标签错配的接头是新一代“接头暗语”基础配置。适用于非低频突变检验,如遗传病,消费基因组检测。



图 6. UDI接头相关结构和产品信息。

xGen Dual Index with UMI · “3合1接头”

这种接头含有UDI元件,并且i7 index后连接有9nt的UMI,可以实现一种接头,三种灵敏度的检测,从而帮助客户进行标准化的生产[4]。这种接头对于希望用一套SOP实现不同类型DNA样本文库构建的用户来说尤其适用。



图 7. xGen®️ Dual Index with UMI接头相关结构和产品信息。

xGen Duplex Seq Adapters| 双端UMI

这种接头为带有3 bp UMI的截短型Y状退火接头,双端的UMI标记可用于回溯和验证测序结果在原始DNA双链上的一致性(Duplex Consensus Reads)。xGen Duplex Seq Adapters和UDI Primer Mix搭配使用,通过Indexing PCR反应构建全长NGS文库,同时引入UDI Index,从而允许多样本混合测序[5]。

这种接头一般应用于肿瘤研究中的超低频突变检测,可检测0.1%甚至更低频率的突变。


图 8. xGen®️ Duplex Seq Adapters接头相关结构和产品信息。


参考文献


[1] https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/whitepapers/index-hopping-white-paper-770-2017-004.pdf

[2] https://sg.idtdna.com/pages/education/videos/next-generation-sequencing/videos/default-source/webinar-videos/next-generation-sequencing/webinar_dual_index_adapters_downey_120617

[3] https://sg.idtdna.com/pages/products/next-generation-sequencing/adapters/xgen-dual-index-umi-adapters-tech-access

[4] https://sg.idtdna.com/pages/products/next-generation-sequencing/adapters/xgen-duplex-seq-adapter-tech-access



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