纳昂达科技欢迎您!联系电话:400-8717-699
暂无图片
您当前的位置:天天彩票下载app > 小纳专题 > Adapter专区

Adapter专区

正本清源—TruGrade® Oligo护航你的高灵敏度检验

检测低频特异序列,如草垛寻针,本已艰难。真实世界的污染却不请自来,生产上常常猝不及防。多篇文章已经表明样本测序的错误分配主要来源于三个方面 :1)测序跳跃,2)实验污染,3)合成污染。

 第一个问题的解决方案敲这里 UDI;第二个靠自己操作‘稳’‘准’‘狠’;第三个请往下看。

Oligo合成引起的样本交叉污染

最近的研究表明,接头(dapters)和扩增引物(Indexed Primers)在DNA Oligo合成过程中,会引入不同程度的交叉污染,主要取决于Oligo供应商和生产方式[1]

假阳性突变和不一致的测序读长可能来自于低质量的接头或Indexed Primer合成:低纯度(高比例的非全长接头产物)和交叉污染(来自其他接头种类污染)。

传统的纯化方式,如HPLC、PAGE,可提高全长产物的比例,但是无法移除交叉污染。如果不进行功能验证,仅依靠分析工具将很难检测交叉污染程度,而轻微的交叉污染就会影响某些高灵敏度检验应用场景(图1)。



图1.易受到低质量接头影响的NGS应用。

TruGrade® DNA Oligos 应用于高灵敏度NGS

为满足NGS实验中更高灵敏度的应用,IDT推出了专利生产流程的TruGrade DNA Oligos合成。TruGrade DNA Oligos在合成和纯化过程中经过物理隔离,可将交叉污染降低至0.01%。

使用3种合成方式的Indexed Primer构建测序文库(除3、8、15、20号Indexed Primer外):

  • 1~12号HPLC纯化(Company A)

  • 13~24号PAGE纯化(Company B)

  • 1~24号TruGrade® DNA Oligo。

3种文库分别混合上机和数据拆分,可发现从未使用过的Indexed Primer 3、8、15、20也拆分出一定数量读长,相关数据见表1[1]

表1. Indexed Primer合成方式对数据正确分配的影响



HPLC和PAGE纯化方式分别有0.56%和0.34%的读长被错误分配到未使用过的Index中,但是TruGrade® Oligo仅有0.03%,比前两者降低10倍以上。TruGrade级别的Adapter Oligos,使得一些灵敏度在千分之一级别的NGS检验结果更可信。

基因界的“国之重器”--国产测序仪BGISEQ系列备受关注。近期发表在bioRxiv的文章展示BGISEQ本身在测序阶段几乎不引入Index hopping。


图2 BGISEQ测序仪

8个基因的扩增片段的分别建库混合后于华大BGISeq-500测序平台上进行测序。测序数据表明,来源于Index 2和Index 3标记的EFEMP2基因和LOX基因文库读长被错误的分配到Index 7中(图2)。这部分读长Q30很高,且这两个Index与Index 7的汉明距离均>8,可排除测序错误。研究人员推测,可能是Index 2和Index 3在生产过程中被Index 7污染。如果排除Index 7的相关数据,则整体的交叉污染率可降低至0.0124% [2]



图3. PCR建库文库混合上机发生的标签错配。绿色背景:被正确分配读长;黄色背景:可能由交叉污染引起的错误分配读长,棕色背景:代表其他错误分配读长

同一篇文章,研究者针对HPV病毒分型检测的实验中,所有的NGS oligo均采用TruGrade®方式合成,文库之间的交叉污染率平均仅为0.0004%,整体的污染率控制在0.0118%。研究者因此建议使用IDT TruGrade® Oligo,从合成的源头避免样本标签错配[2,3]。

在常规测序中,针对Illumina® 测序平台,我们提供了多种商品化的接头产品(更多请敲《NGS接头暗语》)。这些接头中的UDI(Unique dual index)元件可以在数据分析时剔除包括接头合成污染在内多种因素引起的错误分配读长。

在低频或超低频特异序列检测的相关应用中,无论是扩增子测序还是捕获测序,无论哪个测序平台,TruGrade® DNA oligo都可以进一步控制合成过程中的微小污染,做到“正本清源”。守护你的高灵敏度检验。


TruGrade® DNA Oligo服务

表2中,列出了IDT目前提供TruGrade® DNA Oligo服务:

                                                                    表2. TruGrade DNA Oligos相关参数


*通过IDT工厂质检方法或客户使用实例参考数值


关于超低频突变和接头,您可能感兴趣:


《“超低频假阳性突变”这件小事》

《NGS中基于分子标签突变检验的数据分析实践》

《样本先生|您戴错帽子了》

《NGS接头暗号 | 论一个全能接头的”自我修养”》

《接头暗语》


参考文献

[1] Quail MA,Smith M,et al.(2014) SASI-Seq: Sample assurance spike-ins, and highly differentiating 384 bar coding for Illumina sequencing.BMC Genomics.15:110.

[2]Li Q,Zhao X,Zhang W,et al.(2018) Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB- Based NGS Platform.bioRxiv:343137

[3]郑小乐,(2018)样本总是“戴错帽子”?解读错配率趋于0的DNA纳米球技术,测序中国

esToEG822tnlm/Uq8zzwN6dgGXfFSSIlExZfNQlUXdmUz6rhRhCmsIOHKmz0Voeva0uO88v4MbyXJLEffcv/kqcfyZbdZTSe6JCnmuZIh57ZEJt3fASQAzGrm88rHKnxveSmbkaYhN5oqCzvTWWTES89FGl3otZzp0sEZjINUnuGHCBbFHfIC2Qk+pSBrMvcVpvBJ2aL+ZHiuCedWsSo0/ZIsurUarg9