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CRISPR专区

您要佩奇DNA & RNA?

IDT作为DNA合成领域的“领头羊”,一直致力为客户一站式佩(配)奇(齐)多种生物学应用所需核酸序列,专治各种DNA & RNA合成的“疑难杂症”。

这篇文章,我们小结下日常被咨询最多的关于核酸序列合成的典型问题。

问题 1:你们能合成 ___ bases长度的DNA/ RNA吗?

这种情况一般都是来咨询长链DNA/RNA合成。IDT提供具有行业领先耦合效率Ultramer®️ DNA和Ultramer®️ RNA产品,可以直接合成长达200 base 单链DNA和120 bases 单链RNA。通过克隆纯化的方法,还可合成长达2,000 bases的长单链DNA。另外,IDT也可合成从长达数kb的双链DNA。

耦合效率为平均每个碱基被准确合成的效率,Ultramer®️技术的优势在合成长序列时尤为明显(图1)。以200 bases DNA Oligo为例,在耦合效率为98.5%的工业标准下,全长产物比例仅为5%,远远低于Ultramer®️技术下38%的全长终产物。Ultramer技术可帮研究人员获得更长,更纯的单链核酸。


图1. Ultramer技术的耦合效率(A)Ultramer DNA;(B)Ultramer RNA。

小应用

在CRISPR介导的基因编辑的同源重组(Homology directed repair, HDR)应用中,长单链DNA常被用来做HDR模板。详情可以参考下面文章。

问题 2:你们能合成___修饰吗?

IDT可以合成带有修饰的序列,修饰序列可以游刃有余的在克隆、多种杂交、酶联免疫反应、基因编辑等多种生物学应用中大显身手。

常见修饰分类


每种修饰的功能不一而足,本篇文章我们管中窥豹,以核酸酶抗性功能为例简介一些修饰。后续我们将给大家带来更多关于修饰的知识点。

在RNAi,CRISPR基因编辑等应用中,为了不出现DNA/RNA“出师未捷身先死”的状况,核酸酶抗性修饰就显得尤为重要。


硫代修饰

即为硫代磷酸酯键(Phosphorothioate bonds, PS bonds),硫原子替代在序列磷酸盐骨架中非桥接的氧,增强核苷酸之间的连接,使其核酸酶的抗性更强。

IDT建议序列两端可添加硫代修饰以阻止核酸外切酶的分解。若全序列“装备”硫代修饰,整个序列便可抵抗核酸酶的攻击,但是核酸的细胞毒性也相应增加,需酌情选取。


磷酸化

3’磷酸化修饰可以阻止3’核酸外切酶对序列的降解。此外,还有常见的5’磷酸化,可用于接头、克隆、基因构建及一些连接酶催化的连接反应。


C3 Spacer

C3 Spacer是常用间臂修饰的一种。该修饰在3’端可以阻止核酸外切酶发生功能,也被用来阻挡引物延伸。

此外,如果想减少荧光染料、生物素等修饰与核酸的相互作用,也可以选取多个C3 Spacer修饰作为亲水的间隔。

修饰碱基

除了上述修饰外,一些经过特殊修饰的碱基也可以起到阻止核酸降解的作用,如甲氧基修饰碱基、氟代碱基、反向脱氧胸腺嘧啶。

小应用

IDT提供经过优化的Alt-R® CRISPR-Cas9基因编辑系统工具,包含如下3种形式的引导RNA(guide RNA, gRNA)。


这三种gRNA均经过IDT专利的化学修饰,来保护gRNA不被细胞内RNases降解,提高编辑表现。尤其是crRNA XT:tracrRNA和sgRNA,推荐使用在高核酸酶环境

另有研究表明,CRISPR介导的HDR中,若模板ssDNA 5’和3’端添加硫代修饰,将提高细胞内的核酸酶抗性,HDR效率相应提高[1]。

除以上举例的修饰基团外,IDT还提供除以上修饰外更多的修饰。经常被咨询的有氨基修饰,生物素修饰,巯基修饰,多种荧光基团与淬灭基团等。

更多修饰,可移步IDT官网,我们后续也会为大家带来更详尽的说明。

https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications

问题 3:引物、探针序列里含有连续的G和T,实验表现不好怎么办?

如果遇到了这种情况,可以尝试使用IDT专利修饰的Super G®️ 和Super T®️ 碱基。两者均可被DNA聚合酶正常的延伸。

Super G®️ 可减少因多个G碱基存在易形成的non-Watson-Crick二级结构,并且和G碱基不同,Super G®️ 不会使相邻荧光染料的亮度降低,可以提高qPCR探针的表现。Super T®️ 可增加Tm值,稳定双链,可以应用于AT-rich序列的引物或探针。

问题 4:我想订购应用于二代测序的序列,你们有什么建议吗?

二代测序中,文库构建步骤的接头与扩增引物,捕获步骤的探针与封阻序列,本质来讲都是修饰核酸序列。


文库接头

以Illumina平台的Y型接头为例,两条DNA链,一条5’端磷酸修饰,一条3’端几个碱基一般带有硫代修饰,标记为TC*T或T*C*T。


图2. Illumina平台接头序列信息及常用修饰。

正如问题1提到的,硫代修饰是为了防止末端的Overhanging T碱基在连接的过程中被体系中的核酸酶“误伤”;5’磷酸修饰主要功能是A-T连接的过程中形成磷酸二酯键。纳昂达提供多种商品化的接头,详情可以参考下文。

《NGS接头暗语》

TruGrade

NGS高灵敏度检验中,必须严格控制NGS接头和含Index扩增引物合成过程中的交叉污染。IDT专利 TruGrade®️ DNA Oligo,将交叉污染降低至0.01%。关于接头和TruGrade®️合成更详细的信息,可以参考下文,在此不多做赘述。

甲基化接头

除此以外,针对重亚硫酸盐测序,IDT可提供定制的甲基化的接头(Methylated adapters),即接头中所有的C碱基被替换为修饰碱基5-Methyl dC,后续不受重亚硫酸氢盐转化的影响。

图3. 甲基化修饰的胞嘧啶核苷酸结构。

纳昂达作为专业的靶向整体解决方案的提供者,我们提供多种商品化和定制的NGS Oligo。更详细的信息,欢迎留言或联系support@nanodigmbio.com。

问题 5:我想订购大规格的序列,用于分子诊断试剂盒的生产,如何保证序列质量?

IDT有能力为多种应用合成大规模、高质量、多种包装形式的核酸原料。分子诊断试剂盒的研发到生产,核酸原料的生产方式可以由适用于科研的RUO级别升级为GMP。


GMP

GMP生产设备经过ISO 13485:2016认证,符合美国FDA质量体系规则21 CFR Part820。可以追踪订购产品的生产流程,如果你选择了IDT GMP级别的产品,将得到

每个订单world-class LIMS* 记录

每个产品的纸质版的质检文件

长期质量协议保证GMP 产品的稳定供应

* LIMS:Laboratory information managment system

包装

序列池、引物对、退火双链DNA等多种服务及灵活的包装方式。

质检方式

除了每条序列生产时默认的电喷雾电离质谱(ESI-MS,图4)质检方法,IDT还可提供毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,图5),分析纯级别的HPLC(Analytical HPLC)等质检方法。

图4. /56-FAM/-/ZEN/-/3IABkFQ/探针ESI-MS质检示例。


图5. HPLC纯化的/56-FAM/-/ZEN/-/3IABkFQ/探针CE质检示例。

IDT作为一个30多年的专注于核酸合成企业,基本能“佩奇”您各种需求的DNA & RNA。我们这篇文章只是简述一二,后续还将继续为大家整理DNA/RNA合成的知识点。

更详细的产品信息,欢迎咨询400 8717 699;support@nanodigmbio.com。

参考文献

[1] J. B. Renaud et al., Improved Genome Editing Efficiency and Flexibility Using Modified Oligonucleotides with TALEN and CRISPR-Cas9 Nucleases. Cell Rep 14, 2263-2272 (2016).


本文主要翻译自IDT官网和相关产品信息。如需转载请联系公众号后台。

https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/modification-highlight-modifications-that-block-nuclease-degradation


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