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【5个小技巧】助您设计CRISPR介导HDR供体DNA

导语

优化实验条件和设计供体DNA模板(Donor template)是获得高同源重组修复率的关键。本文将为大家介绍介绍为什么单链供体模板(Single-stranded donor oligonucleotides, ssODN )在CRISPR介导的同源重组(Homology directed repair, HDR)表现更优,以及如何设计最佳的HDR模板。

CRISPR-Cas9通过使各种模式生物的基因组发生有效的位点特异性变化的方式来彻底改变基因组研究。在Cas9蛋白使DNA发生双链断裂(Double-strand break, DSB)后,哺乳动物细胞能利用内源性DNA修复机制将断裂端连接在一起。细胞修复断裂有两种主要途径:非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)和HDR。



图1. CRISPR介导的NHEJ和HDR。

顾名思义,NHEJ连接DSB端,不需要同源模板。然而,NHEJ活性容易出错,在断裂点处易引入插入或缺失,可能会使目标基因功能异常。因此,NHEJ对基因敲除非常有用。

为了引入精确的序列特异性变化需要另外一种修复途径—HDR。HDR需要包含与断裂点同源臂相同的供体DNA片段,以便通过内源性细胞机制实现HDR[1]。因此,HDR可以无错误地修复DSB,DNA模板可以在同源臂之间进行序列变化,或者在断裂点附近插入更大的片段。

ssDNA供体模板的优点

过去,常用双链DNAs(dsDNA)作为供体模板[2]。但是dsDNA容易被NHEJ修复途径合并,从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合。通过NHEJ同源独立性插入片段也可能会发生DSB脱靶或者产生内源性DSBs。

图2. 以ssODN和dsDNA模版介导HDR产物结果。

dsDNA为HDR模版会存在一部分NHEJ产物。

另外,dsDNAs对培养细胞是有害的,线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低和使细胞产生不良反应[3,4]。为了避免此类结果,研究人员把注意力转到了ssODN 。ssODNs长期在细菌和低等真核细胞里显示出良好的重组效率[5]。相比于dsDNA模板ssDNAs同源臂更短,插入效率更高[6,7]。因此,ssODN将成为HDR的首选模板。

作为全球DNA合成的领头羊,IDT现在提供Megamer Single-Stranded DNA片段合成服务。这些长而高保真的序列非常适合CRISPR HDR实验。Megamer Single-Stranded DNA片段是经NGS验证的长度为200到2000碱基的ssDNA。这些较长的片段支持复杂的位点特异性编辑,例如在老鼠体内产生或插入等位基因[8]

模板设计的注意事项


优化实验条件和设计Megamer供体模板是获得HDR高效率的关键。断点位置、同源臂的长度、SNPs或其他序列变异、可能的二级结构和GC含量都是重要的考虑因素。

确保Cas9酶切点接近于靶点位置

Cas9酶切点与靶点的距离会影响HDR的效率。IDT用短链ssDNA模板研究这种距离对HEK-293细胞的影响。研究发现,当模板插入点与酶切点相距5-10 nt时,HDR效率明显降低。所以建议使酶切位点尽可能的接近插入位点。如果插入位点固定,就限制了操作的选择。这种情况下,建议比起最佳间隔距离,优先考虑操作的选择性。

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图3. HDR donor template 设计示例。引入2 nt碱基替换。

 使用75-100碱基同源臂

供体模板中的同源臂对应于基因组切割位点两侧的序列。同源臂的长度会影响HDR的效率。对于短链ssDNA模板,30-40个碱基同源臂就能产生稳定的HDR. 但是根据我们的研究发现,针对长链ssDNA模板,我们建议设计75-100个碱基同源臂。这是因为不同的生物系统中可能存在HDR效率差异和核酸酶降解的情况。

避免同源臂覆盖于SNPs或者其他序列变异位置

SNPs或者其他序列变异的存在会降低HDR的效率。我们建议验证感兴趣的细胞系(或模式生物)的序列。因为在参考基因组中可能存在没有特征或注释的序列变异。

避免形成二级结构和高GC含量

在设计Megamer过程中,可能会存在非预期的二级结构或者高GC含量的区域。

具体来说,模板的末端区域(通常是同源臂)对GC含量特别敏感。根据IDT几十年DNA合成经验对寡核苷酸二级结构的理解,我们建议将Megamer片段两端的50个碱基的GC含量限制在28%-72%以内,以避免二级结构。如果同源臂的GC含量不在此范围内,我们建议移动或延长同源臂。IDT在线Megamer审查工具将对订购序列的GC含量进行审查。

针对含有loxP位点的Megamer片段的设计建议

Cre-loxP系统是细胞内一个强大的多功能的DNA重组系统(图4)。这个系统是由Cre重组酶和34bp识别序列(loxP位点)组成。loxP的位置和方位决定了侧翼序列的重新排列[8]

图4. Cre-loxP系统示例[9]。(a)loxP序列由2个13bp的回文序列组成,中间被一个8 bp 非对称核心间隔单元分开;(b,c,d)Cre-loxP可以通过重组引入倒位,删除,易位等变异。

一些loxP位点变体在间隔区或者重复序列区中有突变。使用这些非标准的loxP位点可减少重组产物再切除,进而实现更有效的整合。

因长重复区域的存在可能导致非预期重组,所以生产包含两个相同loxP位点的序列会是一个挑战。嵌合在IDT订购系统里的工具能在下单前自动识别提交的Megamer序列,并自动放弃2个loxP位点太靠近的设计。如果模板需要串联loxP位点,我们建议构建一个长度至少为800碱基的Megmer片段,并将2个loxP位点至少间隔500个碱基。或者,你可以使用非标准loxP位点来降低合成序列的复杂性[10]

www.idtdna.com/site/order/megamerentry 使用IDT自动化工具去测试序列的复杂性和识别任何问题区域(图5)。


图5. IDT提供在线Megamer的审查工具。

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Megamer Single-Stranded DNA

IDT 使用最新和最精准的制造工艺合成Megamer片段,从而达到接近克隆的精度和纯度。我们对每个Megamer 片段进行二代测序验证和单链毛细管电泳来确保交付的产品是精确可靠的。

IDT率先使用NGS的方法来确认Megamer序列,因为它比Sanger测序有明显的优势,并且能检测出传统QC检测不到的亚群。Megamer Single-Stranded DNA片段通常是下订单后2-4周发货。

Megamer 产品详情


全文翻译自IDT官网 Megamer single-stranded donor templates(ssDNA or ssODNs) for successful homology-directed repair(HDR) in genome editing applications,原作者为Brian Wang和Bahri Karaçay。如需转载,请联系公众号后台。


  参考文献

[1] LiD, Qiu Z, et al. (2013) Heritable gene targeting in the mouse and rat using aCRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 31(8):681–683.

[2]Shao Y, Guan Y, et al. (2014)CRISPR/Cas-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cellembryos. Nat Protoc, 9(10):2493–2512.

[3]Roth T, Puig-Saus C, et al. (2018)Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genometargeting. Nature, 559(7714):405–409.

[4]Hornung V & Latz E (2010)Intracellular DNA recognition. Nat Rev Immunol, 10:123–130.

[5]Simon JR, Moore PD (1987)Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes insaccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 7(7):2329–2334.

[6]Miura H, Gurumurthy CB, et al.(2015) Crispr/cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion ofartificial microrna using longer single-stranded DNA. Sci Rep, 5:12799.

[7]Yoshimi K, Kunihiro Y, et al. (2016)ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.Nat Commun, 7:10431.

[8]Quadros RM, Miura H, et al. (2017)easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carryingconditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPRribonucleoproteins. Genome Bio, 18:92.

[9]https://www.researchgate.net/figure/Cre-lox-system-A-The-34-base-pair-loxP-sequence-consists-of-an-8-base-pair-core_fig2_283787920

[10]Araki K, Araki M, et al. (2002)Site-directed integration of the cre gene mediated by cre recombinase using acombination of mutant lox sites. Nucleic Acids Res, 30(19):e103.


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