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CRISPR专区

一个神操作!提升CRISPR介导HDR效率数倍



前方干货来袭,阅读时间 2 分钟

CRISPR-Cas9基因编辑工具由于其易用性和普适性,正在前所未有的应用于基因组研究。除了常规的基因敲除,还可利用CRISPR-Cas9将外源DNA精确插入基因组,从而让研究人员更好的探索基因功能或开发动物疾病突变模型,最终实现诸如临床疾病相关突变修复、动植物产量提高等应用。

CRISPR-Cas9介导基因编辑原理

当CRISPR体系切割产生双链断裂后(double-stranded break),细胞内DNA修复遵循以下两种机制:

  • 非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ),断裂DNA直接连接。

  • 同源定向修复 (homology-directed repair ,HDR),细胞依据DNA模板进行同源重组修复。

NHEJ效率很高,但常产生缺失或插入错误。HDR虽然可进行精确编辑,但是效率却很低。之前我们公众号发布过,得到了大家很多关注。本文我们将进一步介绍一项提高HDR的操作。



图1. CRISPR激活细胞内的修复机制

简单易行,可提升HDR效率数倍的同源重组增强剂

美国IDT的研究人员经过长期努力与验证开发出的通用同源重组增强剂—Alt-R®️ HDR Enhancer。其可提高CRISPR-Cas9 介导的HDR效率。HDR Enhancer是一种小分子试剂,可使DNA修复机制更加倾向于发生HDR。


如图2所示,IDT的Alt-R®️ HDR Enhancer可提高4种人细胞系Jurkat、HEK⁠-⁠293、HeLa和K562的HDR插入率,同时无细胞毒性和可检测的其他表型改变。


图2. Alt-R HDR Enhancer可增强多种细胞类型的同源重组修复效率。

靶向人HPRT基因的4 µM RNP复合物(Alt-R S.p. Cas9酶 + crRNA + tracrRNA),4 µM Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer和3 µM HDR模板,电转(Amaxa Nucleaofector电转系统,Lonza)入4种细胞系。电转后,将细胞在含有30 µM Alt-R HDR Enhancer(灰色)DMSO溶剂对照(浅蓝色)中培养。48 h(HEK-293和Hela)或72 h(Jurkat和K562)后,从上述细胞系中提取基因组DNA并PCR扩增出目的片段,之后用EcoRI酶切验证*。


*图2实验中用于HDR的模板引入了EcoRI酶切位点,故可用EcoRI酶切验证重组效率。


IDT进一步验证实验显示HDR Enhancer对S.p. Cas9体系和Cas12a(Cpf1)体系的切割的HDR同样有效。如图3所示,靶向人Jurkat细胞多个基因位点的HDR均有显著提升


图3. Alt-R HDR Enhancer可增强S.p. Cas9和 A.s. Cas12a体系介导的HDR。左侧:靶向人多个基因位点的不同4 µM Cas9 RNP复合物(Alt-R S.p. Cas9酶 + crRNA + tracrRNA),4 µM Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer和3 µM HDR模板,电转(Neon Transfection电转系统,Thermo Fisher)入Jurkat细胞系。右侧:靶向人HPRT基因不同位点的5 µM Alt-R Cas12a RNP复合物,3 µM Alt-R Cas12a Electroporation Enhancer和3 µM HDR模板,电转入Jurkat细胞系。电转后,将细胞在含有30 µM Alt-R HDR Enhancer(灰色)单DMSO溶剂阴性对照(浅蓝色)无处理对照(深蓝色)中培养。48 h~72 h后,从细胞提取基因组DNA并PCR扩增出目的片段,之后用EcoRI酶切验证。

此外,Alt-R®️ HDR Enhancer同样可提高以脂质体转染细胞的HDR。如图4所示,经脂质体转染的Cas9 RNP体系中,加入Alt-R®️ HDR Enhancer后,可提高HPRT基因多个位点的HDR效率。


图4. Alt-R HDR Enhancer可增强脂质体转染细胞的HDR效率。靶向人HPRT基因多个位点的10 nM RNP复合物(Alt-R S.p. Cas9酶 + crRNA + tracrRNA),1.2 µL 脂质体(Lipofectamine RNAiMAx,Thermo Fisher)和3 µM HDR模板进行转染。转染后,将细胞在含有30 µM Alt-R HDR Enhancer(灰色)单DMSO溶剂对照(浅蓝色)无处理对照(深蓝色)中培养24 h。之后换新鲜不含任何Alt-R HDR Enhancer 或DMSO培养基继续培养至转染后48 h。从上述细胞中提取基因组DNA并PCR扩增出目的片段,之后用EcoRI酶切验证。

综上,IDT专利的Alt-R®️ HDR Enhancer可最大化HDR效率,改善您的实验:

  • 适用于多种细胞类型

  • 适用与Cas9、Cas12a等基因编辑体系

  • 电转或脂质体转染法均适用

Alt-R®️ HDR Enhancer以3 mM(溶于DMSO)溶液形式运输,便于使用。

试剂

货号

Alt-R® HDR Enhancer, 100 µL

1081072

Alt-R® HDR Enhancer, 500 µL

1081073

Alt-R®️ HDR Enhancer对HDR的提升与细胞类型、编辑位点和插入模板均有关系,如何最大程度提升HDR,可参阅IDT的HDR详细Protocol,联系400 8717 699或support@nanodigmbio.com索取。

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