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工欲善其事必先利其器—CRISPR的“扳手”与“螺纹钉”

2017年,一个名为乔赛亚·扎耶那(Josiah Zayner)的生物黑客在自家的厨房直播对自己基因改造的过程,他将自家公司生产的 CRISPR/Cas9产品直接注入手臂,想要让自己的手臂肌肉更强壮。虽然这个让人啼笑皆非的直男梦想没有实现,但是CRISPR/Cas9系统作为一种简单易行、适用于多种生物的基因编辑方式,未来在实验室中一定会成为和PCR一样的常规操作,让实验小白也能轻松实现对目标基因的改造。


图1. 乔赛亚·扎耶那在家中进行实验

(http://www.chicagotribune.com/lifestyles/health/sc-gene-editing-kit-health-0203-20160203-story.html)


CRISPR/Cas9基因编辑系统主要由两部分组成:相当于“扳手”作用的Cas9蛋白与相当于“螺纹钉”作用的CRISPR向导RNA(guide RNA,gRNA)。螺纹钉”负责对靶位点进行定位,并招募和激活Cas9蛋白;Cas9蛋白则负责切割DNA(图2)。

图2. "分子改造器" CRISPR/Cas9基因编辑系统(http://www.wikimedia.org/wiki/Main_Page)


实现该“分子改造器”的方法有单质粒法、慢病毒转化法等。我们今天为大家介绍一种最短只需要1小时即可启动基因改造的IDT(Integrated DNA Technologies)公司Alt-R®️ CRISPR基因编辑系统。该系统主要采取的转化核糖蛋白复合物(Ribonucleoprotein complex,RNP)的方法,RNP即Cas9蛋白和gRNA结合形成的具有编辑功能的复合物。

3步组装“分子改造器”

Alt-R®️ CRISPR系统的实验操作只需3步,就像把大象放进冰箱一样简单(图3)!


图3.  IDT Alt-R®️ CRISPR/Cas9实验流程


表1所示,IDT同时也提供针对不同模式生物的Protocol,相信总有一款适合你!


欢迎访问www.idtdna.com/protocols 获取最新的CRISPR实验方法


优化的“螺纹钉”


在IDT Alt-R®️ CRISPR系统中,组成“螺纹钉”gRNA的“零件”crRNA和tracrRNA均经过了特殊优化(图4)。天然tracrRNA较长,含89个碱基,合成复杂且费用较高。优化后的67个碱基的通用型tracrRNA,可与特异的crRNA在体外结合形成gRNA。36个碱基的crRNA包括结合靶序列的结构域(含20个碱基)和结合tracrRNA的结合域(含16个碱基)。

图4. IDAlt-R®️ CRISPR/Cas9 系统组成


IDT通过实验证明36碱基的crRNA和67碱基的tracrRNA组合效率高,且二者均添加了特殊化学修饰,可使gRNA具有核酸酶抗性。为便于追踪和筛选被成功转化的细胞,可在tracrRNA中添加荧光基团修饰。


你只需要提供符合要求的20个碱基靶序列即可下单crRNA(图5),搭配IDT公司的通用tracrRNA和Cas9蛋白,只需要稍加组装,即可成为直入基因组靶区腹地的神器。值得一提的是,与其他CRISPR/Cas9方式相比,RNP的细胞毒性低、不易引起免疫反应,且在体外即可对DNA片段进行切割,便于在预实验中初步验证“分子改造器”的效率。

图5. 目标特异性crRNA只需20碱基的靶序列即可下单定制

如图6所示,IDT在线工具提供针对人、大鼠、小鼠、斑马鱼、线虫等多种模式生物的预设计crRNA序列库。用户只需选择物种和输入基因名即可获取预设计位点。

图6. IDT crRNA在线设计工具

(https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN)


如果预设计库中没有针对靶目标的“螺纹钉”,你可以输入Fasta序列进行定制设计并利用在线“crRNA检查器”(CRISPR-Cas9 crRNA Checker)排查潜在的脱靶位点。IDT在线工具凝结了很多科学家实践多年的心血,在设计层面充分把控了脱靶风险。

降低脱靶率的“扳手”

 

人类干细胞上的测试结果表明,与其他高保真Cas9酶比,IDT的Alt-R®️ S.P. HIFI Cas9呈现出稳定的中靶编辑活性,脱靶率又极低。我们被这个高保真的Cas9酶的表现所折服,已在使用它来开发基于基因编辑的疾病治疗方案。


                                                                           ____马修·波特斯(Matthew Porteus) 博士

                                                                                       干细胞移植专家,美国斯坦福大学



Dr. Porteus所提的在人类干细胞测试中胜出的高保真Cas9酶,为IDT科学家通过对250000个Cas9突变体筛选后,优化出的Alt-R®️ S.P. HIFI Cas9酶。该酶使CRISPR系统成为更精确的基因组编辑工具。众所周知,CRISPR基因编辑的脱靶效应及错误剪切使其成为医疗应用领域的潜在隐患。针对该问题,IDT提供了Alt-R®️ S.P. HIFI Cas9 蛋白,适合对脱靶效应敏感的应用。


如图7所示,Alt- R® HIFI Cas9蛋白与Kleinstiver等人发表的SpCas9-HF1 (Kleinstiver et al., Nature 529:490-495)以及Slaymaker等人发表的eSpCas9(Slaymaker et al., Science 351:84-88)在脱靶率上的表现高度一致:即相比普通的野生型Alt-R®️ S.P. Cas9蛋白,对EMX1,HEKSite4或VEGFA3基因编辑的脱靶效应显著降低;同时,Alt-R®️ HIFI Cas9蛋白的有效切割效率丝毫不受影响。


图7. Alt-R®️  S.P. HIFI Cas9 以RNP形式导入时,既保证了靶向编辑效率,又减少了脱靶率。

Alt- R 普通野生型Cas9蛋白(深蓝色)、Alt-R HIFI Cas9蛋白(橙色)、SpCas9-HF1 (浅蓝色)、eSpCas9(灰色)4种蛋白分别与靶向EMX1,HEKSite4或VEGFA3基因的Alt-R crRNA : tracrRNA gRNA结合形成1 μM RNP复合物。利用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂将10 nM的RNP转染到HEK-293细胞系。48小时后提取基因组DNA进行切割率分析:通过对目标位点的PCR扩增,随后用T7EI核酸内切酶切割,并使用片段分析仪Fragment Analyzer™(Adavanced Analytical)进行分析。图表下方为crRNA序列的中靶与脱靶位点(红色表示protospacer原件中的错配;蓝色表示PAM位点中的错配)。


目前,IDT Alt-R®️ CRISPR系统及Alt-R®️ S.P. HIFI Cas9酶的优越性已得到许多实验室的认证,频繁应用于多种系统中(图8)。

图8.  IDT Alt-R®️ CRISPR系统被多篇发表在高质量期刊的文献所引用


除了以上的“扳手”和“螺纹钉”,针对整个编辑流程IDT还提供下列试剂为你的基因编辑保驾护航。Alt-R®️ Genome Editing Detection Kit,可用于快速检测CRISPR的编辑效率;Alt-R®️ CRISPR-Cas9 Electroporation Enhancer可用于提高难转化细胞系的电转效率。


工欲善其事必先利其器。上海纳昂达作为美国IDT公司在中国大陆地区的独家授权代理商,提供以上全套神器。如你有任何IDT Alt-R®️ CRISPR相关技术问题,请联系我们support@nanodigmbio.com。


产品介绍

Alt-R®️ CRISPR/Cas9 基因编辑


CRISPR guide RNAs

CRISPR endonuclease


Control kits


Electroporation Enhancer


声明:以上未标注出处的资料来源于IDT官网。纳昂达独家翻译,如需转载,联系纳昂达科技公众号后台。


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